Takashi SAKATA R&D, Sysmex公司 4-4-4 Takatsukadai, Nishi-ku, Kobe 651-2271, Japan. 關(guān)鍵詞： 流式細胞儀 半導體激光 有核紅細胞 聚次甲基染料 介紹 有核紅細胞的測定除了能對地中海貧血等疾病的確診治療提供重要信息外，還能夠對慢性的骨髓組織增生性疾病，例如骨纖和慢性增生性白血病提供有用的信息。由于傳統方法(人工顯微鏡法)通常計數100個(gè)細胞所以在準確度和精密度存在問(wèn)題。此外，典型慣用的血液分析儀不能完全區分有核紅細胞和白細胞，有核紅細胞影響了白細胞的計數。為了解決這些問(wèn)題，運用不同的流式細胞儀技術(shù)改進(jìn)了有核紅細胞的計數方法，但是幾乎沒(méi)有得到滿(mǎn)意的結果。 XE-2100使用了全新研發(fā)的有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR) 和帶紅色半導體激光的流式細胞儀探頭得以精確地計數有核紅細胞。 本文闡述了有核紅細胞的檢測試劑(STROMATOLYSER- NR)和XE-2100有核紅細胞通道的檢測原理。此外，介紹了一種運用流式細胞儀的有核紅細胞計數的新的參考方法。 有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR) 有核紅細胞檢測試劑(STROMATOLYSER-NR)包含了含聚次甲基的染料和含有表面活性劑的酸性低滲透稀釋液。下面介紹該試劑的成份和機制。 染液(聚次甲基染料) 對于細胞染色，不同的細胞使用不同的染料進(jìn)行染色?？偠灾?，為使細胞染上顏色并能夠被流式細胞儀檢測到，這種染料必須具備下列特性: 1) 熒光性能：吸收光束的能力 （如：XE-2100 紅色半導體激光 波長(cháng) 633nm） 2) 有細胞膜的滲透性，尤其是與所測細胞成分相關(guān)。 3) 只有相關(guān)的靶細胞成份發(fā)出熒光。 4) 化學(xué)穩定性。 5) 低毒性 我們研發(fā)了滿(mǎn)足上述條件并在633nm半導體激光照射下發(fā)出熒光的聚次甲基染料。在現代工業(yè)中，聚次甲基染料作為一種常用的功能性染料，運用于近紅外吸收染料、激光染料、LB細胞膜和彩色膠片感光劑。在細胞儀領(lǐng)域，聚次甲基染料可被運用到細胞膜染色，但是它實(shí)際很少在血液學(xué)和病理學(xué)中用作染料。但是，它下述的特性使它非常適合用作細胞染色。 1) 聚次甲基染料的結構特點(diǎn)包含了一個(gè)環(huán)(含有氮、硫和氧的循環(huán)混合物)和一個(gè)甲基鏈(-CH2=)的捆綁結構，這種環(huán)已知是種螢光色基，許多染料都包含這種結構。（圖1） 圖1: 聚次甲基染料分子示意圖 理論上通過(guò)改變環(huán)的原子核的種類(lèi)，捆綁的側鏈以及甲基鏈的長(cháng)度可以設定聚次甲基染料的所吸收的波長(cháng)。比如，捆綁結構中的甲基鏈上增加一個(gè)甲基，可以使聚次甲基染料所吸收的波長(cháng)增加100nm. 這樣，聚次甲基染料具有優(yōu)點(diǎn)就是通過(guò)改變染料分子結構相當容易地得到所希望吸收的波長(cháng)。 2) 改變聚次甲基染料的分子結構不但可以容易地控制對細胞膜和細胞核膜的滲透性，還可以控制對細胞的親和力。通常，聚次甲基染料的分子結構上帶有陽(yáng)離子，很容易與核酸、陰離子結合。它也可以和雙螺旋的DNA相結合。 在稀釋液的討論中將描述細胞膜的滲透性。 3)聚次甲基染料的獨有特性是在水溶液中不能發(fā)出熒光，被吸收的光能通過(guò)分子內部的傳播運動(dòng)轉化成熱能，一旦與細胞膜或核酸結合后，由于分子內部的傳播運動(dòng)被阻礙，加大了聚次甲基染料光能的吸收和熒光強度。 4) 聚次甲基染料是一種化學(xué)性質(zhì)不穩定的物質(zhì)，它很容易被水、光和氧氣所分解。但是在STROMATOLYSER-NR中，運用乙烯乙二醇（非水的溶劑）作為儲存劑，聚次甲基染料變得相當穩定。另一方面，染料當作廢液排放到環(huán)境中會(huì )被分解，化學(xué)性質(zhì)的不穩定反而變成優(yōu)點(diǎn)。 5) 據報道聚次甲基染料是安全的，和典型的與核酸結合的熒光染料（乙基溴化物）相比具有很低的致突變性。 據此，作為染料，聚次甲基染料具備了出色的性能。在XE-2100中，研發(fā)和使用最合適的聚次甲基染料不但可以用于有核紅細胞通道，還可以運用到4分類(lèi)和網(wǎng)織紅細胞通道，多種的正常和異常細胞可以分類(lèi)和計數。 稀釋液 （溶血素） 用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行白細胞計數時(shí)，抗凝的外周血用適合的稀釋液稀釋。 下面講述稀釋液的一些作用。 1)全血的稀釋 如果全血沒(méi)有被稀釋就進(jìn)行測量的話(huà)，對于血液分析儀來(lái)說(shuō)，細胞的數量太多了以至于無(wú)法計數，因此樣本必須稀釋到一個(gè)合適的濃度使細胞可以一個(gè)個(gè)地通過(guò)測定儀。通常白細胞測定時(shí)，全血被稀釋10倍到100倍。 2) 紅細胞的溶解 在外周血中紅細胞的數量是白細胞的1000倍，這會(huì )干擾有核紅細胞的計數。為了消除紅細胞的影響，紅細胞必須有選擇地溶解掉。 3) 細胞的處置 為了確切地染色和區分需要測量的細胞， 生理化學(xué)條件如pH值和離子濃度要依照所測量細胞調到最合適的值，在STROMATOLYSER-NR中用了酸性的低滲的溶液。 4) 染料滲透性的調整 聚次甲基染料具有相當好的細胞膜滲透性， 在STROMATOLYSER-NR中加入了一種染料滲透性促媒，能在短時(shí)間內完成染色(1/10秒內)。 稀釋液除了具備多種性能，比如溶解紅細胞、調整染色性能、增加染料滲透性以外，還要維持其他血細胞的形態(tài)。 本節詳細介紹紅細胞的溶解。 溶解紅細胞的四種基本方法： 1) 改變滲透壓 2) 在懸浮液中降低表面活性 3) 溶解細胞膜 4) 膜物質(zhì)和其他物質(zhì)之間強烈的生理化學(xué)的反應。(15) 已有多種溶解紅細胞的方法報道(16-21). 表1 溶血素 主要分類(lèi) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 備注 低滲液 ? 對白細胞無(wú)損害 ? 能維持細胞的形態(tài)和特點(diǎn) ? 通過(guò)液體的酸性pH值可以使紅細胞選擇性的溶解 ? 紅細胞被溶解，但是由于紅細胞的膜形成的碎片，所以不適合電阻抗的檢測方法。 ? 通常適用于光學(xué)方法。 陽(yáng)離子激活劑 ? 非?？焖俚娜苎磻?? 相當少的紅細胞碎片 ? 細胞損害相當大，細胞的形態(tài)也可能改變。 ? 通常適用于電阻抗方法。 非離子表面活性劑 ? 非?？焖俚娜苎磻?? 紅細胞碎片徹底溶解 ? 細胞損害相當小。 ? 兩者都適合。 全自動(dòng)血液分析儀用的溶血素分為三大類(lèi)（表一），依據所測量的細胞選擇合適的溶血素。在STROMATOLYSER-NR稀釋液中紅細胞幾乎被全部溶解，酸性的低滲液含有陽(yáng)離子表面激活劑使得有核紅細胞和白細胞的染色能力不同。 染色 大 強 小 弱 微小 尺寸 熒光 溶解 白細胞 有核紅細胞 紅細胞 圖2: 有核紅細胞通道測量原理 光柵 聚光鏡 二色鏡 聚光鏡 流式細胞 聚光鏡 光敏二極管 光電倍增器 633nm激 光二極管 濾光器 熒光管 （超過(guò)660nm的熒光） 圖3: 光學(xué)系統方框圖 有核紅細胞的測定原理 (圖2和 圖3) 將血液和有核紅細胞的測定試劑“STROMATOLYSER-NR”相混合，使紅細胞膜表面的脂質(zhì)成份溶解，在細胞膜的表面形成孔道。紅細胞中的血紅蛋白滲出，只剩下光學(xué)透明的細胞膜。有核紅細胞在相同的反應機制下，細胞表面形成孔道，在血紅蛋白滲出的同時(shí)，染液快速滲入。白細胞象有核紅細胞一樣在細胞表面形成孔道，染液快速滲入。白細胞的細胞器仍然存在細胞中，不溢出。在這種情況下，STROMATOLYSER-NR中的聚次甲基染料對核酸、細胞器、白細胞核進(jìn)行染色。另一方面有核紅細胞的核很難和染料結合，因為它的核染色質(zhì)發(fā)生固縮，不易著(zhù)色。 著(zhù)色后的細胞排成流式細胞，并被633nm的紅色激光束照射，測得細胞所產(chǎn)生的前向散射光強度和側熒光強度。二維散射圖的橫坐標表示側熒光強度、縱坐標表示前向散射光強度。 1) 由于紅細胞在稀釋液（溶血素）的作用下，只剩下細胞膜（碎片），光散射很低，所以它的前向散射光強度很低。由于紅細胞的膜幾乎不能被染色，所以側熒光強度很低，它出現在原點(diǎn)附近的左下區域，這就是紅細胞碎片區。 2)白細胞在稀釋液的作用下，盡管在細胞膜的表面生成了孔道，但白細胞仍然保持了形狀，它的散射光很強；白細胞被聚次甲基染料強烈著(zhù)色，它的側熒光強度很強，因而出現在散射圖的左上（或中間）的區域，就是白細胞區域。 3)有核紅細胞在稀釋液的作用下，核幾乎裸露，前向散射光強度較低，又因為細胞較難被聚次甲基染料著(zhù)色，故而它出現在碎片區（低熒光強度）和白細胞區域之間，這是有核紅細胞區域。 圖4： 有核紅細胞散點(diǎn)圖 熒光強度 熒光強度 如上所述，由于有核紅細胞和白細胞兩者的前向散射光強度和側熒光強度不同，所以可以把兩者區分開(kāi)來(lái)，有核紅細胞能被精確地計數和區分（圖４）。根據NCCLS H20- A22評估標準，用這種方法計數得到的有核紅細胞數大于20個(gè)／μL，可以用有核紅細胞的百分比(/100WBC) 和絕對值(/μL)表示。 有核紅細胞參考方法 一般地說(shuō)，評價(jià)血液分析儀的白細胞分類(lèi)能力，NCCLS H20-A的標準方法是使用顯微鏡鏡檢。人工的方法是一種極好的方法，它能夠對多種血液細胞進(jìn)行評估，但是由于它計數的細胞數量少，所以它有眾所周知的統計學(xué)問(wèn)題。雖然儀器進(jìn)行細胞分類(lèi)計數還是一個(gè)問(wèn)題，人工方法不總是正確和客觀(guān)的方法。我公司設計了一種以流式細胞儀原理為基礎的參考方法，對血液分析儀的性能進(jìn)行評估。最近我公司新設計了一種以流式細胞儀原理為基礎的有核紅細胞的參考方法，可對血液分析儀的有核紅細胞計數能力進(jìn)行評估（圖5和6）。這種方法運用了單克隆抗體(標記CD45抗體的FITC)對每一種細胞都染色，能夠識別白細胞普通抗原、核酸染料（propidium iodide），特別能對有核紅細胞進(jìn)行檢測和計數。所以，白細胞、有核紅細胞，紅細胞碎片能夠被清楚地區分開(kāi)，有核紅細胞的百分比能被精確計數。這種方法測定了一萬(wàn)個(gè)細胞（和人工方法計數100個(gè)白細胞相比較），它的精確性相當高。 下圖顯示了使用XE－2100和流式細胞儀測定有核紅細胞的評估結果，列舉了一個(gè)樣本的測定結果。 圖5：用流式細胞儀檢測有核紅細胞的例子 圖6：流式細胞儀與XE-2100檢測有核紅細胞的相關(guān)性 結論 多參數血液分析儀的技術(shù)能力被不斷地拓展。儀器現在測定和區分的細胞類(lèi)型在以前被認為在“電子上”不能區分。在這份報告中，闡述了XE-2100計數有核紅細胞的原理，著(zhù)重評估了STROMATOLYSER-NR試劑的性能。這些訊息將有助于確認XE－2100有核紅細胞計數的精確性和伴隨的臨床應用。我們相信全自動(dòng)血液分析儀在將來(lái)對于健康預防將不斷地給臨床帶來(lái)巨大的幫助，引進(jìn)和解釋新的技術(shù)給你是我們永恒的任務(wù)。我們希望這將有助于你理解和樹(shù)立起信心，相信我們將來(lái)能計數那些目前還不能計數的細胞。 參考書(shū)目: 1 ) Schwartz FO, Stanbury F. : Significance of nucleated red blood cells in peripheral blood. JAMA, 154 : 1339-1340, 1954. 2 ) Weick JK, et al. : Leukoerythroblastosis : diagnostic and prognostic significance. Mayo Clin Proc, 49 : 110-113, 1974. 3 ) Nelson D A, Morris MW: Basic examination of blood. In : Henry JB editor. Clinical diagnosis and Management by laboratory method, 18th edition. Philadelphia : W. B. Saunders Company, P 589-590, 1991. 4 ) Koepk JA, et al. : A Critical evaluation of the manual/visual differential leukocyte counting method. Blood Cells, 11 : 173-186, 1985. 5 ) Terstappen LW, et al. : Discriminating between damaged and intact cells in fixed flowcytometric samples. Cytometry, 9 : 548- 556, 1998. 6 ) Nippon Kankoh-Shisiko Kenkyusho Co., Ltd. : editor. Kankoh- Shisikiso, 1st edition. Tokyo : Sangyo-Tosyo, 1997. 7 ) Waggoner AS : Optical probes of membrane potential. J Membrane Bio, 27 : 317-334, 1976. 8 ) Waggoner AS : Dye indicators of membrane potential. Ann Rev Biophys Bioeng , 8 : 47-68, 1979. 9 ) Waggoner AS : Fluorescent probes for cytometry, Flow Cytometry and Sorting (2nd Edition), pp. 209-225, 1990. 10) Berman HM, Young PR : The Interaction of intercalating drugs with nucleic acids. Ann Rev Biophys Bioeng, 10 : 87-114, 1981. 11) Lee LG, et al. : Thiazole Orange : A new dye for reticulocyte analysis. Cytometry, 7 : 508-517, 1986. 12) Rye HS, et al. : Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes : properties and applications. Nucleic Acids Research, 20 : 2803-2812, 1992. 13) Singer VL, et al. :Comparison of SYBR Green I nycleic acid gel stain mutagenicity and ethdium bromide mutagenicity in the Salmonella / mammalian microsome reverse mutation assay Ames test. Mutation Research, 439 : 37-47, 1999. 14) Matsumoto H: The technology of reagents in the automated hematology analyzer Sysmsex XE-2100-red fluorescence reaction. y= 1.0711x - 0.0037 r = 0.9789 NRBC # N=36 0.60 0.40 0.20 0.00 0.00 0.20 0.40 0.60 XE-2100 NRBC# (′103/ L) FCM NRBC# (′103/ L) Fig. 6 Correlation diagram of NRBC counts between FCM and XE-2100 10 10 10 10 10 1 2 0 3 4 10 10 10 10 10 1 2 0 3 4 Green Fluorescence CD45+/PI- CD45+/PIbright CD45-/PIdim CD45-/PIbright Red Fluorescence RBC ghosts, debris, Lyse resistant RBC and platelets Fig. 5 Example of NRBC measurement by FCM Sysmex Journal International Vol.10 No.1 (2000) Sysmex J Int, 9 : 179-184, 1999. 15) Kondo T : Hemolysis by surface-active agents. Hyommen, 5 : 630- 635, 1967. 16) Dodge JT, et al. : The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Archives Biochem Biophys, 100 : 131-139, 1963. 17) Thron CD. : Hemolysis by holothurin A, digitonin, and quillaia saponin: Estimates of the required cellular lysin uptakes and free lysin concentration, 145 : 194-202, 1964. 18) Kondo T, Tomizawa M : Hemolysis by nonionic surface-active agents. J Pharm Sci, 57 : 1246-1248, 1968. 19) Tmonizawa M, Kondo T : Mechanism of hemolysis by anionic suragface-active agents. Kolloid-Z u Z Polymere, 246 : 694-699, 1971. 20) Kondo T, Tomizawa M : Hemolytic action of surface-active electrolytes. J Colloid Interface Sci, 21 : 224-228, 1966. 21) Helenius A, Simons K: Solubilization of membrane by detergents. Biochim Biophys Acta, 415 : 29-79, 1975. 22) National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) : NCCLS H-20A 23) Lebeck LK, et al. : White blood five-part subpopulation estimations : A flow cytometric based reference method. Sysmex J Int, 5 : 77-84, 1995. 24) Tsuji T, et al. : New rapid flow cytometric method for the enumaeration of nucleated red blood cells. Cytometry, 37 : 291-301, 1999.